通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒（熒光探針法，免提?。?/p>

【主要成分】

【作用與用途】

本試劑盒用于定性檢測非洲豬瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV）特異性核酸片段，為臨床監測和診斷非洲豬瘟病毒感染豬提供檢測數據。非洲豬瘟確診應根據臨床癥狀，流行病學及實驗室檢測結果進行綜合判定。

【檢測原理】

本試劑盒以PCR方法結合熒光探針，核酸提取與純化同步操作，直接通過實時監測PCR擴增產物的累積過程中熒光信號的變化對非洲豬瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)的特異性核酸片段進行檢測。

【用法】

1.適用樣本類型本試劑盒適用于豬口鼻眼拭子、組織和血液或血清等樣本中非洲豬瘟病毒的核酸檢測。

2.樣本采集

2.1口鼻眼拭子樣本的采集：

采集患病豬口鼻眼拭子樣本，用專用采樣棉簽，適度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物，眼分泌物要用拭子在眼瞼下充分擦拭，迅速將棉簽放入裝有400μL樣本稀釋液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。拭子采樣以溶解到樣本稀釋液中可以看到組織懸浮物為最佳。

2.2組織樣本的采集：

無菌采集病豬組織樣本約0.1g，置于1.5mL無菌離心管中。

2.3全血樣本的采集：

抽取豬靜脈血1mL，置于含有適量抗凝劑的采血管中（抗凝劑建議采用EDTA或檸檬酸三鈉，不應采用肝素）；

2.4血清樣本的采集：

抽取豬靜脈血1mL,注入無菌收集管中，室溫不超過4小時（約30-60分鐘），待樣本自行析出血清，或直接1600rpm離心5分鐘分離出血清，轉移至新的滅菌離心管中備用。

3.保存

采集的待測樣本可立即用于檢測，待測樣本在2～8℃保存不應超過三天；-20±5℃保存不超過一個月；-70℃以下可以長期保存。應避免反復凍融。

【操作程序】

1.擴增試劑準備

從試劑盒中取出ASFV-PCR反應液、ASFV-陰性對照品和ASFV-陽性對照品，待所有組分完全溶解后，振蕩混勻5秒，瞬時離心5秒。

2.樣本處理

2.1口鼻眼拭子樣本處理：

無需樣本處理，即可直接上樣。

2.2組織樣本處理：

取約黃豆粒大小組織樣本（約0.1g）置于無菌1.5mL離心管中，加入200μL樣本稀釋液，使用手持式組織研磨儀充分研磨至勻漿。另取出一個新的無菌1.5mL離心管，加入30μL組織樣本裂解液，再加入30μL組織勻漿液，渦旋混勻，置于95℃加熱5min后，12000rpm離心2min，吸取上清液5μL上樣。

2.3血液樣本處理：

全血樣本處理：經樣本稀釋液稀釋10倍后，即可直接上樣；

血清樣本處理：經樣本稀釋液稀釋5倍后，即可直接上樣。

3. 加樣

按下表體系，在0.2mLPCR管中配制反應液。試劑用畢后將剩余試劑立即放入-20±5℃保存。

3.1在一個分裝有反應液的PCR反應管中加入5μL的ASFV-陰性對照品；

3.2將步驟2.樣本處理中取得的待檢樣本充分震蕩混勻，然后按照5μL/樣本分別加入分裝有反應液的PCR反應管中；

3.3在最后一個分裝有反應液的PCR反應管中加入5μL的ASFV-陽性對照品；

以上操作建議在冰浴條件下進行，操作完畢壓緊管蓋，瞬時離心。

注：使用卡尤迪生物科技Mini8全系列熒光定量PCR儀時，建議使用無色透明的0.2mLPCR管，切勿使用有顏色，磨砂的PCR管，因為該儀器熒光讀取方式為側面激發和收集熒光信號。

4. PCR擴增

將反應管放置到PCR檢測儀內，記錄加樣順序。

4.1按下表設置反應條件

4.2熒光通道的選擇

請選擇FAM通道檢測ASFV的核酸。

【判定】

1.試驗成立條件：

1.1陰性對照品FAM檢測通道無S型擴增曲線；

1.2陽性對照品FAM檢測通道有典型S型擴增曲線且Ct值≤23；

1.3陰、陽性對照品檢測符合上述結果，則實驗有效。

2.結果判定

2.1如果樣本在FAM 通道有典型S型擴增曲線且Ct值≤23，則判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陽性；

2.2如果FAM通道有典型S型擴增曲線且 Ct值在23-30之間，則需要復檢。復檢結果如果樣本FAM 通道仍有典型S型擴增曲線且Ct值≤30，則判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陽性，否則為陰性。

【注意事項】

1.開始檢測前請仔細閱讀本說明書，按要求操作。

2.各區物品均為專用，不得交叉使用，避免污染；實驗后立即清潔工作臺。

3.擴增產物的污染，很容易出現假陽性結果。因此，臨床實驗室應嚴格按照《臨床基因擴增實驗室工作規范》配備設備及操作人員。

4.本試劑盒檢測結果僅供科研使用，對病豬的臨床診治應結合其癥狀/體征，病史，其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

5. 檢測為陰性，并不代表為非感染狀態，具體診斷結果須結合其他臨床診斷結果判斷。造成檢測為陰性的可能是：①不合理樣本采集、轉運及處理、樣本中病毒濃度過低，②未經驗證的其他干擾因素如：服用抗病毒藥物等。

6.樣本中DNA濃度低于本產品的最低檢出限時可能出現假陰性。

7.核酸反應液分裝時應盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各熒光定量PCR反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄漏污染儀器。

【儲存與有效期】

本試劑盒中樣本裂解液和樣本稀釋液應儲存于 2～8℃；其余組份應儲存于-20±5℃的避光條件，有效期為12個月，盡量避免反復凍融。